Pero en el Siglo XVI los españoles llegarían a la zona, y ya para el Siglo XVIII el panorama étnico habría cambiado drásticamente a causa de la irrupción europea. Algunos grupos se mixogenizarían y sufrirían la aculturación acriollándose, mientras otros, diezmados por las pestes, serían substituidos por los Pehuenches, los Ranqueles y los Puelches, todos mapuchizados.

Hoy ciudad capital de la provincia, San Luis fue fundada en agosto de 1594 por Luis Jufré de Loasyla y Meneses como parte integrada al Corregimiento de Cuyo con cabecera en la ciudad de Mendoza, jurisdicción en Chile y dependencia del Virreinato del Perú. Abandonada a su suerte, en 1596 una refundación por parte de Martín García Oñez de Loyola le daría el nombre de San Luis de Loyola Nueva Medina de Río Seco. Tras varios traslados y denominaciones, finalmente en 1689 quedaría ubicada en su emplazamiento contemporáneo.

Con la formación del Virreinato del Río de la Plata, en 1777 el Corregimiento de Cuyo sería separado de la jurisdicción chilena. Varios años más tarde, comenzaría la lucha por la independencia provincial. Así, San Luis proclamaría su autonomía administrativa del Gobierno de Cuyo en marzo de 1820, y para 1855, el Gobernador Justo Daract ya habría jurado la Constitución Provincial.

La disputa territorial con las provincias vecinas, especialmente con Córdoba y La Rioja, se extendería durante largos años, hasta que, culminando el Siglo XIX, mediante tratados interprovinciales aprobados por las Legislaturas correspondientes, quedarían finalmente determinados los límites de San Luis.